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pcr檢測法測定馬鈴薯黑脛病菌的標準
上海千實精密機電科技有限公司行業資訊：近日，一項由中國檢驗檢疫科學研究院、上海海關、廣州海關技術中心聯合起草的《馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法》已經編制完成，現正面向社會公開征求意見。
據了解，為了制定出切實可行的標準，在標準研制之初，標準起草小組就收集和整理了大量有關馬鈴薯黑脛病菌的文獻資料，包括病菌的分布、寄主、生物學特性、風險分析、檢測方法和新研究進展等。實驗室在該病菌正式命名之前就已經分離到了菌株，后期又收集到了同屬的其他種菌株，這為此后的分子檢測方法建立以及實際應用等信息數據為《馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法》的制定奠定了堅實的基礎。
《馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法》是一項適用于進出境種球、花卉和種苗等植物繁殖材料中馬鈴薯黑脛病菌的檢疫鑒定以及馬鈴薯黑脛病的田間調查與監測的標準。標準也詳細規定了馬鈴薯黑脛病菌的檢測和鑒定方法，其原理是寄主感病后癥狀特點明顯，莖基部和薯塊感染后出現變色和軟腐，可以取樣有癥組織進行pcr初檢后分離，或按照細菌常規分離方法分離目的菌，隨后根據被害癥狀、菌落形態特征、Biolog測試結果、煙草過敏性反應、致病性測試以及分子生物學檢測等進行病菌的分離、檢測和鑒定，需要用到的儀器設備有超凈工作臺、培養箱、冰箱、高壓滅菌鍋、水浴鍋、離心機、pcr儀、實時熒光pcr儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統、電子天平、渦旋振蕩器和移液器等。
征求意見稿中還明確規定了病菌分離的步驟和流程：取癥狀組織病健交界處組織少許，70%酒精表面消毒30s，滅菌水洗3次后轉入1mL滅菌水中，浸泡15min，取組織浸出液在營養瓊脂培養基NA平板上劃線分離，也可將浸出液稀釋10倍、100倍和1000倍后分別取100μL涂布NA平板，28℃下培養2-4d后挑取疑似菌落，純化三次后用于后續試驗。典型菌落淡黃色，煎蛋狀，中央突起，邊緣不規則。
此外，標準中采用的常規PCR檢測方法和實時熒光檢測方法均未正式發表，但是已經在口岸進行了6年的測試，包括測試了引進的陽性對照菌株和分離鑒定的菌株以及同屬下的所有不同種，均未發現有假陽性擴增，并且對比測試了此前文獻報道的檢測方法，測試結果顯示文獻報道的引物ds-f/ds-r和探針ds-p可以擴增除Dickeya solani以外的其他部分種。
